白腐真菌酶系具有獨(dú)特的降解機(jī)理,對(duì)包括木質(zhì)素、多環(huán)芳烴、氯代芳烴、染料、炸藥、農(nóng)藥等多種難降解有機(jī)污染物有很強(qiáng)的降解能力[ 1, 2 ] ,這種特殊的降解機(jī)制展現(xiàn)了巨大的潛在應(yīng)用前景,引起了學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的極大興趣[ 3 ] 。自從Tien等[ 4 ]和Glenn 等[ 5 ] 同時(shí)發(fā)現(xiàn)白腐真菌黃孢原毛平革菌( Phanerochaete chrysosporium )對(duì)木質(zhì)素降解的關(guān)鍵是其產(chǎn)生的胞外過(guò)氧化物酶系的作用后,人們對(duì)該菌比較重要的3 種酶即木質(zhì)素過(guò)氧化物酶( ligninperoxidase,簡(jiǎn)稱L iP) ,錳過(guò)氧化物酶(Mn2dependentperoxidase,簡(jiǎn)稱MnP)和漆酶(Laccase)進(jìn)行了廣泛研究。黃孢原毛平革菌對(duì)異生物質(zhì)的降解主要依賴于由該菌細(xì)胞分泌的胞外酶進(jìn)行,需氧并啟動(dòng)一系列的自由基鏈反應(yīng),實(shí)現(xiàn)對(duì)底物的無(wú)特異性的氧化分解[ 6 ] 。細(xì)胞外的非專(zhuān)一性的降解體系,使污染物不必進(jìn)入細(xì)胞,從而使該菌對(duì)不溶的、有毒的、結(jié)構(gòu)各異的物質(zhì)均有作用能力。另一方面,這種關(guān)鍵酶胞外工作的特點(diǎn)要求除了必須滿足菌體需要的營(yíng)養(yǎng)限制(限碳或限氮) 、足夠的供氧等環(huán)境條件外,還要避免其胞外酶的結(jié)構(gòu)及活性遭受剪切力等因素的破壞。因此,所用反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)和運(yùn)行參數(shù)對(duì)其產(chǎn)酶至關(guān)重要。本文就白腐真菌的培養(yǎng)方式與條件、反應(yīng)器的選擇等方面較為系統(tǒng)地闡述了反應(yīng)器對(duì)其產(chǎn)酶的影響。

　　1木質(zhì)素降解酶系的酶活性定義及測(cè)定方法

　　1. 1　酶活性定義

　　酶是生物催化劑,所以酶活性(也稱酶活力)的大小常用它催化某一種特定反應(yīng)的能力來(lái)表示。酶活性的大小,也就是酶量的多少,用酶的活力單位( active unit,簡(jiǎn)稱U)來(lái)度量。1961年國(guó)際生物化學(xué)學(xué)會(huì)( IUB)酶學(xué)會(huì)議規(guī)定: 1個(gè)酶活力單位,是指在特定條件下,在1 min內(nèi)能轉(zhuǎn)化1μmol底物的酶量,或是轉(zhuǎn)化底物中1μmol的有關(guān)基團(tuán)的酶量。酶的比活性( specific activity)也稱為比活力,是指每毫克蛋白所具有的酶活力單位數(shù)。比活力是表示酶制劑純度的一個(gè)重要指標(biāo)。對(duì)同一種酶來(lái)說(shuō),酶的比活力越高,純度越高。

　　1. 2　測(cè)定方法

　　木質(zhì)素降解酶系的酶活性測(cè)定常用分光光度法,此方法不需要昂貴的儀器,操作簡(jiǎn)便快捷,對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的要求也不是太高,因此應(yīng)用較為普遍。酶標(biāo)儀原理與分光光度計(jì)相同,但它可同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品并實(shí)現(xiàn)了進(jìn)樣讀數(shù)的自動(dòng)化,特別是與計(jì)算機(jī)聯(lián)用后,使酶活性的測(cè)定過(guò)程更為簡(jiǎn)單快捷,準(zhǔn)確可靠。在緩沖環(huán)境下,L iP活性測(cè)定體系中,以藜蘆醇為底物;MnP活力測(cè)定體系中,常以Mn2 +為底物,添加H2O2 啟動(dòng)反應(yīng); Laccase活力測(cè)定體系中,常以ABTS為底物,測(cè)定酶對(duì)其的氧化速度。

　　2　培養(yǎng)方式與條件

　　2. 1　培養(yǎng)方式

　　在白腐真菌產(chǎn)酶的培養(yǎng)方式上,研究最多的是液體培養(yǎng),采用振蕩培養(yǎng)的情況比靜置培養(yǎng)的多,采用深層培養(yǎng)比淺層培養(yǎng)的多。近年來(lái)固體培養(yǎng)的報(bào)道越來(lái)越多。付時(shí)雨等[ 7 ]發(fā)現(xiàn):固體培養(yǎng)條件下貝殼狀革耳菌產(chǎn)生的漆酶活性遠(yuǎn)大于它在液體培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的酶活性,而且對(duì)同功酶的產(chǎn)生有較大的影響。固態(tài)培養(yǎng)具有操作簡(jiǎn)便、成本低廉、產(chǎn)酶率高、耗能低等優(yōu)點(diǎn),更重要的是它的產(chǎn)酶條件更接近于自然條件下白腐真菌的生長(zhǎng)狀態(tài),更適于工業(yè)化大規(guī)模產(chǎn)酶。Couto等[ 8 ]研究了在固態(tài)條件下培養(yǎng)白腐真菌連續(xù)操作產(chǎn)酶時(shí)發(fā)現(xiàn):該操作有效避免了菌絲的過(guò)度生長(zhǎng)、菌絲周?chē)嗵呛褪姑甘Щ钗镔|(zhì)如蛋白酶等的生成等。MnP酶活性在第11 d達(dá)到峰值180 U /L,平均酶活性為75 U /L;而LiP酶活性同樣在第11 d達(dá)到峰值313 U /L,平均值為Carvalhoc等[ 9 ]在填充床中以半連續(xù)操作方式獲得酶活的11倍。

　　2. 2　營(yíng)養(yǎng)條件

　　常用的培養(yǎng)基主要包含碳氮源、緩沖液、微量元素、生長(zhǎng)因子等。因黃孢原毛平革菌的降解功能主要發(fā)生在次級(jí)代謝階段,與降解有關(guān)的酶只有當(dāng)一些主要營(yíng)養(yǎng)物(如氮、碳)受到限制時(shí)才能合成。營(yíng)養(yǎng)限制使黃孢原毛平革菌應(yīng)答產(chǎn)生了對(duì)底物的降解酶系統(tǒng)。李越中等[ 10 ]發(fā)現(xiàn):糊精是最優(yōu)碳源,混合糖源比單獨(dú)糖源好。在氮源中,酵母浸汁和牛肉膏培養(yǎng)物中木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性最高,低碳高氮培養(yǎng)基有利于酶的合成。 Dosoretz等[ 11 ]考察了通氧和通空氣對(duì)2種過(guò)氧化物酶合成的影響,發(fā)現(xiàn)空氣條件下菌絲不合成木質(zhì)素過(guò)氧化物酶,能合成錳過(guò)氧化物酶但低于通氧時(shí)產(chǎn)生的酶活性。而柯世省等 [ 12 ]的研究結(jié)果表明,空氣環(huán)境下限碳培養(yǎng)黃孢原毛平革菌,合成的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶最高酶活性可達(dá)360 U /L,比通純氧條件下限碳培養(yǎng)時(shí)的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性要高160%。這可能是由于過(guò)量地通氧增加了葡萄糖的消耗,產(chǎn)生較多的蛋白酶和多糖,從而抑制了酶活性,酶活性越過(guò)峰值后下降也越快。由此可見(jiàn),在提高酶活性方面,有些結(jié)果是看似相互矛盾,需要具體情況具體分析。Dosoretz等[ 11 ]的研究結(jié)果表明:在限氮培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)階段和次級(jí)代謝階段分別生成初級(jí)蛋白酶和次級(jí)蛋白酶,它們對(duì)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶有破壞作用。為提高合成酶的能力,可以采用流加葡萄糖或加入蛋白酶抑制劑來(lái)減小這種作用。在限碳培養(yǎng)條件下, Kirk等[ 13 ]發(fā)現(xiàn)緩沖液以鄰苯二甲酸對(duì)產(chǎn)酶最有利,培養(yǎng)的最佳pH是415。Fenn 等[ 14 ] 認(rèn)為二甲基琥珀酸緩沖液(DMS)是較好的緩沖液, DMS是目前最常用的緩沖液。Kirk等[ 13 ]研究了添加藜蘆醇和微量元素對(duì)合成木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的影響,發(fā)現(xiàn)添加一定量的這兩種成分,不僅顯著提高了酶活性,而且酶活性的總量也有增加。他們還證明了維生素B1 是菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)生木質(zhì)素降解酶系所必需的唯一維生素。Jager等[ 15 ]報(bào)道在靜置培養(yǎng)中黃孢原毛平革菌可以合成木質(zhì)素過(guò)氧化物酶,但在搖瓶培養(yǎng)中只有加入吐溫等表面活性劑才能合成,并且通過(guò)添加表面活性劑span280 (0. 05% )成功地解除了振蕩培養(yǎng)對(duì)產(chǎn)酶的抑制(轉(zhuǎn)速為200 r/min) ,從而為生物反應(yīng)器的研究開(kāi)辟了道路。吐溫80的最佳濃度是0. 05% ～0. 1% ,此濃度下它不僅增加了細(xì)胞膜的通透性,解除了已合成的酶在胞內(nèi)的積累所產(chǎn)生的抑制作用,而且還有一定的生理作用。Asther等[ 16 ]研究了溫度對(duì)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶合成的影響時(shí)發(fā)現(xiàn):一般來(lái)說(shuō)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)結(jié)束后降低溫度有利于次級(jí)代謝物的啟動(dòng),因此為提高產(chǎn)酶量可以把培養(yǎng)溫度分為2個(gè)階段來(lái)控制:第一階段是生長(zhǎng)階段,第二階段是木質(zhì)素過(guò)氧化物酶系合成階段?？刂粕L(zhǎng)溫度為37 ℃、酶合成期溫度為30 ℃培養(yǎng)所得的最高酶活與溫度恒定在37 ℃培養(yǎng)相比,要高1倍多。綜上所述,白腐真菌產(chǎn)酶的培養(yǎng)方式多為液體培養(yǎng),常采用限碳或限氮培養(yǎng)基,加入維生素和表面活性劑,通入空氣或氧氣等措施來(lái)強(qiáng)化產(chǎn)酶。然而即使同一菌種,在不同反應(yīng)器中的最佳產(chǎn)酶條件也不盡相同。目前的研究也都還集中在實(shí)驗(yàn)室的中小型反應(yīng)器階段,這些都為白腐真菌酶系的大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用帶來(lái)一定困難。

　　3　細(xì)胞的生長(zhǎng)方式

　　近年來(lái),采用固定化細(xì)胞培養(yǎng)合成木質(zhì)素降解酶系已經(jīng)引起了廣泛的重視,和游離細(xì)胞培養(yǎng)相比,它能更有效地合成木質(zhì)素降解酶系。至今,已報(bào)道過(guò)多種載體對(duì)黃孢原毛平革菌的固定,其中用尼龍網(wǎng)、聚丙烯、燒結(jié)玻璃、多孔陶瓷、不銹鋼、硅管、瓊脂糖、瓊膠顆粒和聚(苯乙烯2二乙烯基苯)均取得了較好的效果。菌絲固定化后,穩(wěn)定性增強(qiáng)并且可以很方便地重復(fù)利用來(lái)合成木質(zhì)素降解酶。很可能是不與流體直接接觸的內(nèi)層菌體免受剪切力的影響,酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)和活性中心不易被破壞,也就提高了酶活性。張朝暉[ 17 ]對(duì)限氮培養(yǎng)基在純氧環(huán)境下培養(yǎng)黃孢原毛平革菌合成木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的條件進(jìn)行了研究,在搖瓶培養(yǎng)中,較大的菌絲球和較小的通氧強(qiáng)度將延遲酶的合成。在 175 r/min的轉(zhuǎn)速下,用聚氨酯泡沫固定化培養(yǎng),木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的最高酶活性比游離菌絲球培養(yǎng)時(shí)提高1倍。Ruckenstein等[ 18 ]用多孔聚合物固定黃孢原毛平革菌,在限碳時(shí)培養(yǎng)合成木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(聚合顆粒形狀為邊長(zhǎng)0. 4 cm的立方狀,比表面積224 m2 /g)時(shí)發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)至第6 d得到最大酶活性為602 U /L,比游離培養(yǎng)所得酶活性( 307 U /L)高1倍,并且達(dá)到最大酶活性時(shí)間也比游離培養(yǎng)提前了8 d。固定化顆粒6周內(nèi)重復(fù)使用了16批,最高酶活性737 U /L,第16批的酶活仍達(dá)到594 U /L。L inko[ 19 ]在8 L 的發(fā)酵罐中用聚氨酯泡沫固定黃孢原毛平革菌,產(chǎn)酶期通55%～70%的氧氣,最高酶活性可達(dá)550 U /L。為了更好地與空氣接觸, Feijoo等[ 20 ]設(shè)計(jì)聚氨酯泡沫塊半懸浮、半浸沒(méi)在培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng),在限碳條件下,最高酶活為300 U /L。上述培養(yǎng),聚氨酯泡沫的用量都很大( 20 g/L 培養(yǎng)基) 。Kirkpatrick等[ 21 ]用少量的聚氨酯泡沫來(lái)固定,最高酶活只有100 U /L。Nakamura等[ 22 ]以聚氨酯泡沫為載體固定菌體,在限氮條件下合成木質(zhì)素降解酶系, L iP、MnP和Lac2case的酶活峰值分別高達(dá)450 000、370 000 和100 000 U /L。由此可見(jiàn),通過(guò)適當(dāng)載體對(duì)菌體進(jìn)行固定,可顯著提高產(chǎn)酶效率。

　　4　不同反應(yīng)器的特點(diǎn)及應(yīng)用

　　反應(yīng)器的構(gòu)型設(shè)計(jì)和參數(shù)確定是關(guān)鍵,也是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。合成酶所用的生物反應(yīng)器應(yīng)該滿足如下基本要求:反應(yīng)器內(nèi)流體混和均勻、剪切力適宜;為了給細(xì)胞生長(zhǎng)和目標(biāo)產(chǎn)物酶的合成提供最佳的環(huán)境條件,需要能夠?qū)Ψ磻?yīng)器中的pH、溫度、溶解氧、氧化還原勢(shì)、攪拌轉(zhuǎn)速等參數(shù)進(jìn)行測(cè)量和控制;必須防止雜菌污染,維持純種培養(yǎng)等[ 23 ] 。

　　4. 1　機(jī)械攪拌式反應(yīng)器

　　機(jī)械攪拌式反應(yīng)器是最常用的反應(yīng)器,它能適用于大多數(shù)的生物培養(yǎng)過(guò)程,已經(jīng)形成標(biāo)準(zhǔn)化的通用設(shè)備。只有在它的氣2液傳遞性質(zhì)或剪切力不能滿足生物過(guò)程時(shí)才會(huì)考慮選用其他類(lèi)型的反應(yīng)器[ 24 ] 。為了防止攪拌時(shí)液體產(chǎn)生渦流,可在反應(yīng)器內(nèi)側(cè)安裝擋板, 以增強(qiáng)液體的徑向混合。L inko等[ 19 ]在10 L的發(fā)酵罐中,把黃孢原毛平革菌固定在尼龍網(wǎng)上,以限碳培養(yǎng)方式合成木質(zhì)素過(guò)氧化物酶。為提高產(chǎn)量,根據(jù)富氧環(huán)境對(duì)產(chǎn)酶有利的特點(diǎn),他們?cè)谏L(zhǎng)期通空氣,而在產(chǎn)酶期通純氧(氧分壓維持在50%～70%) 。第3 d出現(xiàn)酶活性后,多次加入l g/L的葡萄糖刺激酶活性的增加,最高酶活性為730 U /L。Venkatadri等[ 25 ]在普通的發(fā)酵罐中插入纏繞著聚硅氧塑料管的不銹鋼管,在管內(nèi)通氧給生長(zhǎng)在塑料管表面的菌絲供氧,最高酶活性達(dá)到203 U /L,可連續(xù)重復(fù)產(chǎn)酶5周以上。Couto等[ 8 ]在發(fā)酵罐中實(shí)現(xiàn)了固體培養(yǎng),他們采用間歇式操作時(shí),L iP酶活性均值高達(dá)24618 U /L, Laccase 均值為6815 U /L;當(dāng)進(jìn)行30 d的連續(xù)培養(yǎng)時(shí),MnP酶活性均值為150 U /L, Laccase 酶活性均值可高達(dá)330U /L。

　　4. 2　固定床

　　固定床反應(yīng)器的基本原理是反應(yīng)液連續(xù)流動(dòng)通過(guò)靜止不動(dòng)的固定化菌體(或生物催化劑) 。固定化的主要優(yōu)點(diǎn)是可以重復(fù)利用菌體細(xì)胞,便于將菌體細(xì)胞與反應(yīng)產(chǎn)物分離[ 26, 27 ] 。Shim等[ 28 ]把生長(zhǎng)培養(yǎng)基和誘導(dǎo)培養(yǎng)基交替通入到8 L的固定床反應(yīng)器中,間歇培養(yǎng)合成木質(zhì)素過(guò)氧化物酶,最高酶活性為8100 U /L。Mielgo等[ 29 ]以2, 62二甲氧基苯酚為底物,在固定床生物反應(yīng)器中半固體培養(yǎng)黃孢原毛平革菌,最大MnP酶活性達(dá)1293 U /L, L iP酶活性最大為225 U /L。Couto等[ 30 ]在填充有尼龍海綿的管式固定床反應(yīng)器中,以半固態(tài)條件操作進(jìn)行了2批培養(yǎng),第一批中,葡萄糖消耗速率為0157 g/L·d,氨氮在第4 d消耗完,MnP在第3 d開(kāi)始出現(xiàn),酶活性為76 U /L,第7 d達(dá)到峰值為1293 U /L; LiP在第2 d開(kāi)始出現(xiàn),酶活性16 U /L,第8 d達(dá)到峰值為225 U /L;而Laccase的合成不規(guī)則,最大值為33 U /L。在第二批操作中,葡萄糖的消耗速率為0133 g/L·d,此時(shí)MnP在第2 d出現(xiàn)為45 U /L,第6 d達(dá)到峰值956 U /L,比第一批低了35%;而LiP在第2 d出現(xiàn)為20 U /L,第5 d達(dá)到峰值165 U /L,比第一批略微下降; Laccase更不規(guī)則,峰值達(dá)到58 U /L。這也說(shuō)明了營(yíng)養(yǎng)調(diào)控的重要性。固定床反應(yīng)器常用于連續(xù)生產(chǎn),反應(yīng)器可連續(xù)運(yùn)行20多d, Feijoo等[ 31 ]認(rèn)為平推流和完全混合都不利于固定床產(chǎn)酶,產(chǎn)酶的最佳回流比是2∶1。

　　4. 3　滴流床

　　填充床適合于固定化微生物細(xì)胞連續(xù)產(chǎn)酶過(guò)程。一般從上端流出含較高濃度產(chǎn)品的反應(yīng)液,這種情況下,單位體積反應(yīng)器內(nèi)固定化顆粒的裝置量比流化床大得多。但由于固定化細(xì)胞長(zhǎng)期靜止地堆積在一起,隨著細(xì)胞的不斷生長(zhǎng),容易造成營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不良。對(duì)于好氧發(fā)酵,也可以有限度地向填充床通氣,這時(shí)一般稱為滴流床。但由于固定化細(xì)胞裝填過(guò)密以及必須避免產(chǎn)生流化,通氣量受到嚴(yán)格的限制[ 32 ] 。Ruggeri等[ 33 ]利用滴流床生物反應(yīng)器間歇培養(yǎng)黃孢原毛平革菌,反應(yīng)器內(nèi)散堆鞍形填料(填料表面經(jīng)處理形成一層海藻酸鈣薄膜) ,膜內(nèi)固定菌體,培養(yǎng)基循環(huán)利用,在第10 d木素過(guò)氧化物酶活性達(dá)1220 U /L。

　　4. 4　轉(zhuǎn)鼓式反應(yīng)器

　　轉(zhuǎn)鼓式生物反應(yīng)器通常是通過(guò)轉(zhuǎn)盤(pán)或轉(zhuǎn)鼓的旋轉(zhuǎn)達(dá)到混合的目的,其混合程度一般,取決于發(fā)酵的要求。通常是用較低的旋轉(zhuǎn)速度(1～15 r /min) ,高速旋轉(zhuǎn)混合的應(yīng)用很少。原因是高旋轉(zhuǎn)速度會(huì)損傷菌絲體,而且能過(guò)多的產(chǎn)生熱量,影響微生物產(chǎn)酶和其他次級(jí)代謝產(chǎn)物。轉(zhuǎn)鼓式反應(yīng)器的轉(zhuǎn)鼓直徑不宜過(guò)長(zhǎng)、體積不宜過(guò)大,否則不僅操作困難,而且在旋轉(zhuǎn)過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基結(jié)成球狀,從而影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物的利用。除機(jī)械攪拌式反應(yīng)器以外的其他類(lèi)型反應(yīng)器中,轉(zhuǎn)盤(pán)反應(yīng)器最早合成木質(zhì)素降解酶:在2. 5 L的反應(yīng)器中(轉(zhuǎn)速為1 r/min) ,得到最大木質(zhì)素過(guò)氧化物酶活性為30 U /L[ 34 ] 。Dominguez等[ 35 ]采用轉(zhuǎn)鼓式生物反應(yīng)器半浸沒(méi)培養(yǎng)黃孢原毛平革菌,以尼龍海綿為載體,菌絲固定在尼龍海綿體上,采用間歇式培養(yǎng), 通氣量分別為0. 5 L /L· min (升通氣量/升培養(yǎng)基·分鐘)和1 L /L · min時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明:在通氣量為1 L /L· min時(shí)酶活性是015L /L·min時(shí)的3倍,MnP在第11 d峰值達(dá)1350 U/L,LiP在第6 d峰值達(dá)364 U /L。而且在此操作下還出現(xiàn)了Laccase,在第3 d出現(xiàn)峰值為56 U /L。

　　4. 5　鼓泡塔

　　鼓泡塔的主體是一個(gè)容器,通常呈圓柱形,高度和直徑之比通常為4～6。在容器底部通過(guò)多孔管、多孔盤(pán)、燒結(jié)玻璃、燒結(jié)金屬或者微孔噴霧器向反應(yīng)液通氣。為了加強(qiáng)混合,還可以在容器內(nèi)安裝一系列水平的多孔板、垂直的隔板等。鼓泡塔的優(yōu)點(diǎn)是不需要機(jī)械傳動(dòng)設(shè)備、動(dòng)力消耗小、不易污染菌種;缺點(diǎn)是不能提供足夠高的剪切力,傳質(zhì)效率低,絲狀菌有時(shí)會(huì)形成很大的菌絲團(tuán)而影響代謝和產(chǎn)物合成。張朝暉等[ 36 ]以聚氨酯泡沫塑料為固定化載體,在三相鼓泡塔反應(yīng)器中培養(yǎng)黃孢原毛平革菌,可以高效地合成木質(zhì)素降解酶系。實(shí)驗(yàn)表明,合成木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和錳過(guò)氧化物酶的最佳通氣量均是1. 0 L /L· min。在此通氣量下,最大木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的酶活性達(dá)367 U /L,最大錳過(guò)氧化物酶的酶活性達(dá)4720 U /L。在培養(yǎng)基相同和單位體積載體用量相同的條件下,與搖瓶培養(yǎng)相比,酶活性分別增大1倍和1. 2倍。這是因?yàn)樵趽u瓶培養(yǎng)中,氣液間的傳質(zhì)只在液相表面進(jìn)行,而在三相鼓泡塔中,通過(guò)分布器進(jìn)入液相主體的氣體已經(jīng)分散成許多微小的氣泡,大大增加了氣液相界面積,強(qiáng)化了傳質(zhì),氣泡間的擾動(dòng)也大大促進(jìn)了三相間的物質(zhì)傳遞,培養(yǎng)液所受的剪切力比搖瓶小得多。一定條件下,在三相鼓泡塔中可以進(jìn)行重復(fù)間歇培養(yǎng)生產(chǎn)木質(zhì)素過(guò)氧化物酶,連續(xù)進(jìn)行了5批培養(yǎng),每批木質(zhì)素過(guò)氧化物酶的最大酶活性均在250 U /L以上,最高酶活性出現(xiàn)在第二批為480 U /L,總培養(yǎng)時(shí)間達(dá)22 d。

　　4. 6　氣升式反應(yīng)器

　　氣升式反應(yīng)器是應(yīng)用最為廣泛的生物反應(yīng)器,是在鼓泡塔的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。它利用空氣的噴射功能和流體密度差造成反應(yīng)液循環(huán)流動(dòng),來(lái)實(shí)現(xiàn)液體的攪拌、混合和氧傳遞。即不用機(jī)械攪拌(避免了菌絲的纏繞附著) ,完全依靠氣體的帶升使液體產(chǎn)生循環(huán)發(fā)生湍動(dòng),從而達(dá)到氣液混合和傳遞的目的[ 37 ] 。它的容器被一個(gè)隔板或?qū)Я鞴芊指畛上嗤ǖ?個(gè)區(qū)域,其中只有一個(gè)區(qū)域通氣。通氣的區(qū)域稱為上行區(qū),不通氣的區(qū)域?yàn)橄滦袇^(qū)。由于上行區(qū)的氣泡向上流動(dòng),帶動(dòng)著液體從下往上運(yùn)動(dòng),并在頂部與氣體分離后再沿下行區(qū)往下,如此循環(huán)往復(fù)。有時(shí)上行區(qū)和下行區(qū)可以分別是一個(gè)容器,兩者通過(guò)底部和頂部的管道相連,這樣的氣升式反應(yīng)器稱為外循環(huán)的氣升式反應(yīng)器。與攪拌罐相比,氣升式反應(yīng)器增加了促進(jìn)流體循環(huán)的裝置,從而大大改善了相間混合與接觸條件,有利于傳質(zhì)和反應(yīng)過(guò)程,具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單(內(nèi)部沒(méi)有運(yùn)動(dòng)部件) 。不需攪拌、節(jié)省能量、氧傳質(zhì)效率高、不易污染、剪切力小、安裝維修方便等優(yōu)點(diǎn),特別適合于對(duì)剪切力敏感的微生物細(xì)胞[ 38 ] 。Bonnarme等[ 39 ]在7 L (工作體積為5 L)的氣升式反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)了L iP和MnP的分別培養(yǎng),在培養(yǎng)液中Mn ( II)較低濃度515 ×10- 9mol/L 時(shí),可以合成LiP,而在培養(yǎng)液中Mn ( II)濃度高達(dá)212 ×10- 7mol/L時(shí)則合成MnP。在開(kāi)始的12 h內(nèi),氣體的體積流量對(duì)影響菌絲球的形狀至為關(guān)鍵。體積流量0126～0128 L /L時(shí)效果最佳:太高時(shí)導(dǎo)致過(guò)量泡沫,太低會(huì)形成一些大的菌絲團(tuán)塊而不利于傳質(zhì)傳氧,并且酶的合成量很少。培養(yǎng)50 h后MnP的酶活性在低錳條件下出現(xiàn),但從未超過(guò)130 U /L。L iP的酶活性在培養(yǎng)70 h后出現(xiàn),并且穩(wěn)步上升至140h的760 U /L。MnP在高錳條件下培養(yǎng)50 h時(shí)出現(xiàn)(此時(shí)LiP未被檢測(cè)到) ,其酶活性增至94 h時(shí)的950 U /L。由此可見(jiàn),Mn ( II)可以有效地調(diào)節(jié)L iP和MnP的合成。Gerin等[ 40 ]比較了由氣體攪動(dòng)的氣升式反應(yīng)器、鼓泡式反應(yīng)器和有螺旋槳攪動(dòng)的攪拌式反應(yīng)器后發(fā)現(xiàn),氣體攪動(dòng)比機(jī)械攪動(dòng)更有利木質(zhì)素降解酶的合成,氣升式反應(yīng)器。鼓泡式反應(yīng)器中LiP酶活性的最大值分別達(dá)4500 U /L、3140 U /L,MnP酶活性最大值分別達(dá)1944 U /L、1146 U /L,而攪拌式反應(yīng)器中LiP酶活性僅為516 U /L,MnP酶活性最大值僅為618 U /L。這是因?yàn)闄C(jī)械攪動(dòng)影響了木質(zhì)素降解酶的分泌和穩(wěn)定。綜上所述,盡管各種反應(yīng)器都有其自身優(yōu)點(diǎn),但因氣升式反應(yīng)器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、氧傳質(zhì)效率高、剪切力小等優(yōu)點(diǎn),也就更適合白腐真菌產(chǎn)酶效率的提高[ 41 ] 。

　　5　結(jié)　語(yǔ)

　　白腐真菌酶系對(duì)底物有很強(qiáng)的非特異性氧化能力,因此具有廣泛的用途[ 42, 43 ] 。但白腐真菌酶系在自然界中的產(chǎn)率很低。目前國(guó)內(nèi)外就如何優(yōu)化反應(yīng)器提高其產(chǎn)酶效率的研究尚無(wú)定論,反應(yīng)器的設(shè)計(jì)不僅要考慮傳質(zhì)傳氧、檢測(cè)調(diào)控、運(yùn)行維修等反應(yīng)器自身的一般特性[ 44, 45 ] ,還要考慮菌體好氧產(chǎn)酶以及酶易受剪切力破壞等特殊要求[ 46 ] 。因此更深入系統(tǒng)地對(duì)反應(yīng)器進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,掌握各種反應(yīng)器的動(dòng)力學(xué)參數(shù)和反應(yīng)器模型才能使之設(shè)計(jì)更趨完善。酶應(yīng)用的前提條件是大規(guī)模發(fā)酵獲得酶,然而目前尚沒(méi)有大規(guī)模發(fā)酵木質(zhì)素降解酶的報(bào)道。因此如果能把反應(yīng)器放大,使白腐真菌酶系得以大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用,則必將有廣闊的應(yīng)用前景[ 47, 48 ] 。

　　參考文獻(xiàn)

　　[ 1 ] D’Annibale A. , RicciM. , Leonardi V. , et al. Degradationof aromatic hydrocarbons bywhite2rot fungi in a historicallycontaminated soil. Biotechnology andBioengineering, 2005,90 (6) : 723～731

　　[ 2 ] Pazarlioglu N. K. , Urek R. O. , Ergun F. , et al. Biodeco2lourization of direct blue 15 by immobilized Phanerochaetechrysosporium. Process Biochemistry, 2005, 40 ( 5) : 1923 ～1929

　　[ 3 ] Teramoto H. , Tanaka H. ,Wariishi H. Degradation of 42ni2trophenol by the lignin2degrading basidiomycete Phanero2chaete chrysosporium. App liedMicrobiology and Biotechnol2ogy, 2004, 66 (3) : 312～317

　　[ 4 ] TienM. , Kirk T. K. L ignin degrading enzyme from the hym2enomycete Phanerochaete chrysosporium burds. Science,1983, 221: 661～663