近來年, 隨著抗生素的大量使用, 人們開始逐漸關(guān)注環(huán)境體系中的抗生素、抗性菌和抗性基因的分布及行為特點(diǎn)(Li et al., 2015).我國是抗生素生產(chǎn)與消費(fèi)的大國, 抗生素的年生產(chǎn)量約為21×104 t, 年人均消費(fèi)量是美國的10倍(佟娟等, 2012).抗生素的存在是導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的重要原因之一, 細(xì)菌一旦產(chǎn)生抗藥性, 又可通過基因轉(zhuǎn)移的方式傳播, 導(dǎo)致環(huán)境中抗生素抗性菌的污染逐漸嚴(yán)重, 從而對生態(tài)環(huán)境和人體健康造成危害(孔德勇, 2015).污水處理廠由于生活污水、醫(yī)藥廢水、養(yǎng)殖廢水等的排入, 使得這些污水中的抗生素抗性菌也隨之進(jìn)入.國內(nèi)外的污水處理廠均檢測出大量抗生素抗性菌的存在, 已經(jīng)成為環(huán)境中抗生素抗性菌的儲(chǔ)存庫(Kim et al., 2007).但同時(shí), 污水處理也是去除抗生素抗性菌及控制抗性傳播的關(guān)鍵環(huán)節(jié)(Rijal et al., 2009).

目前, 國內(nèi)外已經(jīng)開展了較多關(guān)于污水處理廠抗生素抗性菌的調(diào)查分析, 但多集中在污水處理廠進(jìn)出水中目標(biāo)抗性菌的分布情況, 對于不同工藝及季節(jié)對抗性菌影響的分析較少.Munir等(2011)調(diào)研了MBR工藝(Membrane bioreactor, MBR)、傳統(tǒng)工藝(Conventional activated sludge process, CAS)等不同工藝的出水中抗生素抗性菌的數(shù)量, 發(fā)現(xiàn)污水處理廠出水中仍含大量抗性菌, 且MBR工藝去除磺胺類抗性菌效果更好, 但在去除四環(huán)素抗性菌時(shí)MBR工藝和傳統(tǒng)工藝沒有顯著性差異(p>0.05).相比于傳統(tǒng)工藝, MBR工藝具有運(yùn)行管理方便、占地面積少、處理水質(zhì)穩(wěn)定、脫氮效果優(yōu)良等優(yōu)點(diǎn).但它對抗生素抗性菌的去除是否表現(xiàn)出絕對優(yōu)勢性, 目前還沒有明確結(jié)論.另外, Yuan和Mackuak等在研究不同季節(jié)抗性菌去除效果時(shí)發(fā)現(xiàn), 春、夏季污水處理廠對抗性菌的去除效果優(yōu)于冬季(Mackuak et al., 2014; Yuan et al., 2014).

基于此, 本研究通過調(diào)查無錫市污水處理廠進(jìn)出水中抗生素抗性菌的分布情況, 對比不同工藝及不同季節(jié)污水處理廠抗生素抗性菌的去除效果, 以了解無錫市污水處理廠抗生素抗性菌的現(xiàn)狀, 旨在為未來城市污水處理廠的抗生素抗性菌環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評估和優(yōu)化去除提供理論依據(jù)和技術(shù)支持.

2 實(shí)驗(yàn)部分(Experiments) 2.1 污水處理廠選取及樣品采集

為研究MBR工藝與傳統(tǒng)工藝在去除抗生素抗性菌效果的差異性, 本文選擇位于無錫市的6座污水處理廠, 對其進(jìn)出水中的抗生素抗性菌進(jìn)行調(diào)查, 并依次編碼為A、B、C、D、E及F廠, 各污水處理廠分別設(shè)計(jì)3個(gè)采樣點(diǎn)(F廠為2個(gè)采樣點(diǎn))：1號采樣點(diǎn)位為污水處理廠的沉砂池出水(同一個(gè)污水廠的2種水處理工藝進(jìn)水水質(zhì)相同), 即生化池進(jìn)水;2號采樣點(diǎn)位為MBR工藝膜池出水;3號采樣點(diǎn)位為傳統(tǒng)工藝出水, 其中, A廠出水為二沉池出水, E廠出水為轉(zhuǎn)盤過濾器出水, 其它廠均為濾布濾池出水, 且為了減少不同消毒處理工藝帶來的差異性, 所有出水未經(jīng)過消毒處理.各污水處理廠情況如表 1所示.其中, MBR工藝均為AAO工藝與膜反應(yīng)器的組合形式, 膜生物組件采用中空纖維膜, 膜材料為常見的聚偏氟乙烯(PVDF), 孔徑大小 < 0.5 μm, 并采用抽吸泵抽吸的方式運(yùn)行.膜組件的具體信息如表 2所示.

表 1(Table 1)

表 1 污水處理廠基本情況


 
表 2(Table 2)

表 2 膜組件信息


 
2015年夏季(9月和10月)進(jìn)行2次樣品采集, 2016年冬季(1月、2月和3月)進(jìn)行3次樣品采集.進(jìn)出水樣品各采集50 mL并儲(chǔ)存于無菌采樣瓶, 樣品采集后立即于4 ℃保存, 并在48 h內(nèi)稀釋進(jìn)行接種培養(yǎng)實(shí)驗(yàn).

2.2 抗生素抗性菌的檢測方法

抗生素按其化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為β內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)類、氨基環(huán)醇類和喹諾酮類及其他.同時(shí), 參考我國抗生素的使用情況和抗性菌的分布情況(李振等, 2009; ?uczkiewiczet al., 2010; 陸孫琴等, 2011), 選擇氨芐霉素、紅霉素、四環(huán)素、卡那霉素及環(huán)丙沙星這5種抗生素依次代表常見的5類抗生素, 從而測試無錫市污水處理廠進(jìn)出水中抗生素抗性菌的分布.本研究利用傳統(tǒng)的異養(yǎng)菌平板培養(yǎng)法來檢測目標(biāo)抗生素抗性菌.同時(shí)為了說明抗生素抗性菌占總異養(yǎng)菌的比例, 也檢測了進(jìn)出水中的總異養(yǎng)菌數(shù)量.

首先, 依據(jù)《臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)》(Clinical And Laboratory Standards Institute, CLSI)中抗生素對細(xì)菌的最小抑制濃度確定目標(biāo)抗生素濃度, 具體如表 3所示.

表 3(Table 3)

表 3 目標(biāo)抗生素基礎(chǔ)信息及使用濃度


 
其次, 利用培養(yǎng)基R2A agar(CM0906, OXOID, 配制濃度為18.1 g·L-1)制備抗生素培養(yǎng)基(Zhang et al., 2015), 具體操作為：R2A agar用蒸餾水配好后于121 ℃高壓滅菌20 min, 冷卻至60~70 ℃后根據(jù)表 3中抗生素的使用濃度, 加入一定量的抗生素母液(用于總異養(yǎng)菌計(jì)數(shù)的平板無需添加抗生素, 直接倒平板即可), 與培養(yǎng)基混合均勻后倒入平板中, 待冷卻至室溫后使用.

最后, 檢測抗生素抗性菌.具體操作為：用磷酸鹽緩沖液(PBS, pH=7.4) 將待測水樣梯度稀釋, 取50 μL接種于含抗生素的R2A瓊脂平板中, 在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h, 選取菌落數(shù)為30~300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù), 細(xì)菌計(jì)數(shù)采用細(xì)菌活菌平板計(jì)數(shù)方法(沈萍, 2007).總異養(yǎng)菌的檢測方法同抗生素抗性菌檢測, 只是將接種平板更換為無抗生素平板.

3 結(jié)果與討論(Results and discussion) 3.1 污水處理廠進(jìn)水中抗生素抗性菌的分布

如圖 1所示, 5種目標(biāo)抗生素抗性菌在污水處理廠進(jìn)水中均可檢出, 說明污水處理廠中抗生素抗性菌普遍存在.進(jìn)水中總抗生素抗性菌濃度為1.01×105~2.17×105 CFU·mL-1, 各廠進(jìn)水中總抗生素抗性菌含量排序?yàn)镈廠>C廠>E廠>B廠>A廠>F廠, 5種抗生素抗性菌的含量排序?yàn)榘逼S霉素抗性菌>紅霉素抗性菌>四環(huán)素抗性菌、卡那霉素抗性菌和環(huán)丙沙星抗性菌.其中, C廠和D廠氨芐霉素抗性菌分別為1.48×105 CFU·mL-1和1.66×105 CFU·mL-1;而F廠氨芐霉素抗性菌為8.02×104 CFU·mL-1, 僅為D廠的1/2.

圖 1(Fig. 1)

圖 1 抗生素抗性菌在不同污水處理廠的分布情況(n=5)

本研究調(diào)查的目標(biāo)污水處理廠進(jìn)水中, D廠包括兩家大型醫(yī)院的排水, E廠進(jìn)水中含有制藥廢水, A、B、C、F廠的進(jìn)水中只包含小型社區(qū)醫(yī)院的廢水排放.對照圖 1可知, D廠的總抗生素抗性菌數(shù)量最多, 很可能是由于進(jìn)水中含有較多醫(yī)院廢水和工業(yè)廢水導(dǎo)致, 醫(yī)院廢水中常常含有較高濃度的抗生素(Lindberg et al., 2004; Huang et al., 2011).研究認(rèn)為, 在長期的抗生素驅(qū)動(dòng)壓力下可能誘發(fā)細(xì)菌進(jìn)行選擇性基因突變和基因水平轉(zhuǎn)移(Heuer et al., 2007), 從而增加抗生素抗性菌的數(shù)量(Accinelli et al., 2007).E廠雖然工業(yè)廢水比例較低(10%), 但由于進(jìn)水中含有制藥廢水, 導(dǎo)致其抗生素抗性菌的濃度也較高.由此說明抗生素抗性細(xì)菌的含量分布與區(qū)域周邊生活污水、工業(yè)廢水的排放及人類活動(dòng)等因素密切相關(guān), 此觀點(diǎn)得到Xu等(2015)認(rèn)同.

另外, 本研究中氨芐霉素抗性菌是目標(biāo)污水處理廠進(jìn)水含量最多的抗生素抗性菌.國內(nèi)的研究表明, 污水處理廠β-內(nèi)酰胺類抗性菌的比例高于其他幾種常檢測的抗性菌.例如, Yuan等(2014)研究發(fā)現(xiàn), 污水處理廠出水和活性污泥中總異養(yǎng)菌對頭孢氨芐產(chǎn)生抗性的比例都超過30%, 而對慶大霉素和四環(huán)素產(chǎn)生抗性的比例都低于10%;陸孫琴等(2011)和Yin等(2013)發(fā)現(xiàn), 污水處理廠β-內(nèi)酰胺類抗性菌濃度高于四環(huán)素類抗性菌.其原因主要是氨芐霉素屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素, 這類抗生素是我國醫(yī)療抗生素中最常使用的藥物, 并且常被過量使用(Gao et al., 2012), 該類抗生素的大量排放會(huì)引起其抗性菌的產(chǎn)生.而國外的相關(guān)研究表明, 國外的污水處理廠中含量最多的抗生素抗性菌并不是氨芐霉素抗性菌.例如, Reinthaler等(2003)和Watkinson等(2007)分別發(fā)現(xiàn)從澳大利亞某污水處理廠廢水中分離的大腸桿菌對四環(huán)素的抗性均高于50%.Galvin等(2010)對從愛爾蘭地區(qū)污水處理廠中分離出的大腸桿菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn), 氨芐霉素抗性菌占12.5%~24.5%, 四環(huán)素和環(huán)丙沙星抗性菌分別占12.4%~39.0%和0~7.5%.另外Guardabassi等(2002)對從丹麥的污水處理廠污水中分離的不動(dòng)桿菌進(jìn)行研究, 發(fā)現(xiàn)進(jìn)水中對氨芐青霉素的抗性最弱.由此可知, 不同地區(qū)污水處理廠中同種抗生素抗性菌的含量區(qū)別較大, 這很可能與不同地區(qū)消費(fèi)的抗生素種類不同有關(guān)。

3.2 抗生素抗性菌占總異養(yǎng)菌的比例

污水處理廠進(jìn)水中總異養(yǎng)菌(Heterotrophic plate count, HPC)濃度為1.413×105 ~2.749×105 CFU·mL-1, 出水中總異養(yǎng)菌濃度比進(jìn)水低1個(gè)數(shù)量級, 濃度為0.242×105 ~0.876×105 CFU·mL-1.由表 4可知, 雖然污水處理對抗生素抗性菌有一定的去除能力, 但A廠、D廠及F廠出水中四環(huán)素抗性菌占總異養(yǎng)菌的比例相對于進(jìn)水沒有明顯下降, 反而有增加趨勢, 例如, A廠進(jìn)水中四環(huán)素抗性菌占總異養(yǎng)菌的比例為2.35%, 而出水中增加至5.01%.另外, 出水中卡那霉素、環(huán)丙沙星抗性菌占總異養(yǎng)菌的比例相對于進(jìn)水也沒有明顯降低.

表 4(Table 4)

表 4 不同抗生素抗性菌占總異養(yǎng)菌的比例


Zhang等(2009)在研究中發(fā)現(xiàn), 污水處理工藝能去除1~3個(gè)數(shù)量級的不動(dòng)桿菌和總異養(yǎng)菌, 然而出水中抗生素抗性菌的比例明顯增加.同時(shí), Figueira等(2011)發(fā)現(xiàn)，環(huán)丙沙星和卡那霉素占總異養(yǎng)菌的比例也有出水高于進(jìn)水現(xiàn)象.其中, 關(guān)于四環(huán)素抗生素抗性菌的研究中, Kim等(2007)認(rèn)為, 增強(qiáng)活性污泥有機(jī)負(fù)荷和減少污泥泥齡(SRT)會(huì)導(dǎo)致SBR工藝處理后的四環(huán)素抗性菌增多, 而且抗生素抗性菌所占比例沒有明顯減少.該觀點(diǎn)被很多研究者認(rèn)同, 劉沖等(2013)認(rèn)為可能是由于污水處理工藝沒有選擇性地去除四環(huán)素抗性菌;也可能是活性污泥對四環(huán)素有較好的吸附效果造成(四環(huán)素在活性污泥上的最大吸附量為72 mg·g-1)(宋現(xiàn)財(cái), 2014), 當(dāng)污泥中的細(xì)菌被更多四環(huán)素包圍, 將誘導(dǎo)出更多的四環(huán)素抗性菌或抑制其他抗性菌生長;又有可能是污泥中的四環(huán)素抗性菌隨著出水排出造成, 但這還需進(jìn)一步分析.

總體來看, 污水處理過程雖然可以消減抗生素抗性菌的總量, 但抗生素抗性菌的比例卻有增加趨勢.目標(biāo)污水處理廠選擇性去除抗生素抗性菌的效果不佳, 出水中仍含有大量的抗生素抗性菌, 這些抗生素抗性菌進(jìn)入環(huán)境后會(huì)進(jìn)一步引起水體、土壤等污染, 進(jìn)而危害人類健康.

3.3 工藝對抗生素抗性菌的影響

不同工藝對抗生素抗性菌的去除效果如圖 2所示, MBR工藝對氨芐霉素抗性菌、紅霉素抗性菌有較好的去除效果, 去除率分別為72.00%~91.80%和83.51%~96.50%, 傳統(tǒng)工藝對上述抗生素抗性菌的去除率分別約為72.56%~88.20%和74.48%~93.92%.但MBR工藝對四環(huán)素、卡那霉素和環(huán)丙沙星抗性菌的去除率沒有明顯優(yōu)勢.

圖 2(Fig. 2)

圖 2 不同工藝的抗生素抗性菌去除效果(n=5)

由圖 2還可知, 污水處理廠中MBR工藝和傳統(tǒng)工藝對抗生素抗性菌的去除率都比較高, 尤其是對氨芐霉素和紅霉素抗性菌的去除率最高.研究其化學(xué)結(jié)構(gòu)可知, β-內(nèi)酰胺類和大環(huán)類脂類分別含有酰胺鍵和酯鍵等易水解的敏感化學(xué)鍵(邵一如等, 2013), 抗生素抗性菌含有消除這些脆弱化學(xué)鍵的酶而摧毀這些抗生素的活性, 從而減少抗生素抗性菌的含量.針對不同的抗生素抗性菌, 不同的處理工藝其處理抗生素抗性菌的效果也有所不同.本研究發(fā)現(xiàn), MBR工藝對氨芐霉素抗性菌的去除效率普遍高于傳統(tǒng)工藝.主要原因有:MBR膜池MLSS濃度較高, 為了保持較高的傳氧速率需要加大曝氣強(qiáng)度, 有利于污泥微生物分解抗生素, 從而強(qiáng)化抗生素抗性菌的去除(劉陽等, 2008); MBR膜反應(yīng)器的膜孔徑均不超過0.5 μm, 在兼顧傳統(tǒng)活性污泥的吸附作用的基礎(chǔ)上強(qiáng)化了物理攔截作用;MBR膜反應(yīng)器的水力停留時(shí)間和污泥停留時(shí)間分離, 能夠更好地實(shí)現(xiàn)抗生素的降解和吸附, 提高污水處理工藝對抗生素的去除率, 進(jìn)而改善抗生素抗性菌的去除率(Kim et al., 2005).這一結(jié)果也被其他學(xué)者所證實(shí), Choi等研究發(fā)現(xiàn), MBR工藝對氨芐霉素抗性菌的去除率(高于90%)高于傳統(tǒng)工藝, 并且隨著污泥停留時(shí)間(SRT)的延長去除效果逐漸升高(Choi et al., 2007; Xia et al., 2012);Munir等(2011)在研究MBR工藝和傳統(tǒng)工藝對抗生素抗性菌的去除效果時(shí)發(fā)現(xiàn), 傳統(tǒng)工藝對四環(huán)素抗性菌的去除效果高于MBR工藝.產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是MBR工藝的生化池污泥濃度比傳統(tǒng)工藝高, 而活性污泥對四環(huán)素有良好的吸附性能, 從而導(dǎo)致MBR工藝中由于抗生素壓力或者基因轉(zhuǎn)移產(chǎn)生更多的四環(huán)素抗性菌.其次, 部分研究認(rèn)為, MBR工藝去除難降解有機(jī)物如抗生素等更依賴于化合物自身結(jié)構(gòu), 如苯環(huán)個(gè)數(shù)和所含氯的數(shù)量等(韓磊等, 2009).

總體來說, 通過比較MBR工藝和傳統(tǒng)工藝對污水處理廠抗生素抗性菌的去除率, 發(fā)現(xiàn)不同工藝對不同抗生素抗性菌去除優(yōu)勢性不同.其中, MBR工藝去除氨芐霉素抗性菌和紅霉素抗性菌有一定優(yōu)勢性, 而去除四環(huán)素、卡那霉素和環(huán)丙沙星抗性菌的優(yōu)勢不明顯.

3.4 季節(jié)對抗生素抗性菌的影響

冬、夏季6個(gè)污水處理廠對5種抗生素抗性菌的去除量如表 5所示.由表 5可知, 在所調(diào)研的6個(gè)污水處理廠中, 總異養(yǎng)菌和多數(shù)抗生素抗性菌的夏季去除量均高于冬季去除量, 并且大部分沒有表現(xiàn)出冬、夏季的顯著性差異(p>0.05), 只有環(huán)丙沙星抗性菌表現(xiàn)出冬、夏季的顯著性差異(p < 0.05), 其中, 夏季環(huán)丙沙星抗性菌的去除量為1.525×103~7.12×103 CFU·mL-1, 冬季環(huán)丙沙星抗性菌的去除量為0.9×103~5.25× 103 CFU·mL-1.

表 5(Table 5)

表 5 不同季節(jié)抗生素抗性菌的去除量

對于總異養(yǎng)菌和抗生素抗性菌的夏季去除量高于冬季去除量的現(xiàn)象, 可能是由微生物生長的最佳溫度導(dǎo)致, 夏季溫度較高時(shí)微生物活性增強(qiáng), 難降解有機(jī)物(如抗生素類)在較高溫時(shí)更容易被降解.Yuan等(2014)也認(rèn)為春、夏季抗生素抗性菌多于冬季, 其中, 環(huán)丙沙星去除量有明顯的季節(jié)差異(p < 0.05).環(huán)丙沙星主要用于治療敏感菌引起的呼吸道感染、胃腸道感染、傷寒等疾病, 而冬季屬于流行性感冒等疾病多發(fā)季節(jié), 所以環(huán)丙沙星等抗生素的使用也隨之增加并表現(xiàn)出顯著季節(jié)差異性.Mackuak等(2014)也研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)丙沙星抗生素有明顯的季節(jié)差異性.由此看來, 污水處理廠中抗生素抗性菌的變化與抗生素的使用量關(guān)系密切.因此, 為減少環(huán)境中抗生素抗性菌的數(shù)量, 應(yīng)該嚴(yán)格控制抗生素的使用.

4 結(jié)論(Conclusions)

1)5種抗生素抗性菌在無錫市6座污水處理廠進(jìn)出水中均可檢出, 且抗生素抗性菌濃度與各污水處理廠的工業(yè)廢水和醫(yī)藥廢水比例呈正比.進(jìn)水中濃度為103~105 CFU·mL-1, 出水濃度比進(jìn)水低1~2個(gè)數(shù)量級, 且氨芐霉素抗性菌數(shù)量最多, 占總異養(yǎng)菌的比例超過50%.同時(shí), 部分污水處理廠出水中抗性菌占總異養(yǎng)菌的比例相對于進(jìn)水有增加趨勢.

2) 對比MBR工藝和傳統(tǒng)工藝對抗性菌的去除率, 發(fā)現(xiàn)不同工藝對不同抗生素抗性菌去除優(yōu)勢不同.MBR工藝對去除氨芐霉素和紅霉素抗性菌表現(xiàn)出一定優(yōu)勢, 而MBR工藝對去除四環(huán)素、卡那霉素和環(huán)丙沙星沒有表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢性.

3) 通過比較不同季節(jié)對抗性菌去除量的影響, 發(fā)現(xiàn)夏季抗性菌的去除量略多于冬季, 且只有環(huán)丙沙星抗性菌的去除量表現(xiàn)出顯著的季節(jié)性差異(p < 0.05).